How Proteins Find The Right DNA Sequences

Illustration of how proteins find the right DNA sequences. (Credit: Image courtesy of Uppsala University)

Researchers at Uppsala University and Harvard University have collaboratively developed a new theoretical model to explain how proteins can rapidly find specific DNA sequences, even though there are many obstacles in the way on the chromosomes.





...

In living cells, DNA-binding proteins regulate the activity of various genes so that different cells carry out the right tasks at the right time. For this to work, the DNA-binding proteins need to find the right DNA site sufficiently quickly. The research team behind the new study has previously succeeded in determining that it takes only a few minutes for an individual protein molecule to look through the millions of nearly identical binding alternatives and find the right place to bind. This is nevertheless slower than what is predicted by the established theoretical model for how DNA-binding proteins find their way to the proper place by alternating between diffusing in the cell cytoplasm and along DNA strands.
"By also taking into consideration the fact that there are many obstacles in the way when proteins are to diffuse along DNA strands, we can now calculate more exactly how long it takes them to find their way," says Johan Elf, associate professor of molecular biotechnology at the Center for Bioinformatics.
Besides offering a more precise prediction regarding the time needed to find the right site on DNA, the new theoretical model explains why there is an optimal total concentration of DNA-binding proteins. If there were more, it would simply be impossible for them to find a binding place in a reasonable time, since the proteins would be in each other's way. If there were fewer it would go slower as well, since not enough proteins would be searching. Finally, the new model provides an explanation why so many DNA-binding proteins also bind auxiliary binding sites close to the regulatory site, thus forming DNA loops. It turns out that this can shorten the time to find the right sites.
"This more detailed understanding of gene regulation is important, since it can ultimately provide a better understanding of diseases that occur as a result of problems in the control functions of cells, such as in cancer" says Johan Elf.
The researchers behind the study are Gene-Wei Li, Otto G. Berg, and Johan Elf. The findings are being published March 16 in the scientific journal Nature Physics.
Read more / Selengkapnya...

Bacterial Reproduction

Bacteria are prokaryotic organisms that reproduce asexually. Bacterial reproduction most commonly occurs by a kind of cell division called binary fission. Binary fission results in the formation of two bacterial cells that are genetically identical.

Bacterial Cell Structure

Bacterial cells typically contain the following structures: a cell wall, cell membrane, cytoplasm, ribosomes, plasmids, flagella, and a nucleiod region.

• Cell Wall - Outer covering of the cell that protects the bacterial cell and gives it shape.
• Cytoplasm - A gel-like substance composed mainly of water that also contains enzymes, salts, cell components, and various organic molecules.

...

• Cell Membrane or Plasma Membrane - Surrounds the cell's cytoplasm and regulates the flow of substances in and out of the cell.
• Flagella - Long, whip-like protrusion that aids in cellular locomotion.
• Ribosomes - Cell structures responsible for protein production.
• Plasmids - Gene carrying, circular DNA structures that are not involved in reproduction.
• Nucleiod Region - Area of the cytoplasm that contains the single bacterial DNA molecule.

Bacterial Reproduction:

AsexualMost bacteria reproduce by binary fission. During binary fission, the single DNA molecule replicates and both copies attach to the cell membrane.The cell membrane begins to grow between the two DNA molecules. Once the bacterium just about doubles its original size, the cell membrane begins to pinch inward.A cell wall then forms between the two DNA molecules dividing the original cell into two identical daughter cells.

Bacterial Recombination:

Binary fission is an effective way for bacteria to reproduce, however it does produce problems. Since the cells produced through this type of reproduction are identical, they are all susceptible to the same types of antibiotics. In order to incorporate some genetic variation, bacteria use a process called recombination. Bacterial recombination can be accomplished through conjugation, transformation, or transduction.

Conjugation

Some bacteria are capable of transferring pieces of their genes to other bacteria that they come in contact with. During conjugation, one bacterium connects itself to another through a protein tube structure called a pilus. Genes are transferred from one bacterium to the other through this tube.

Transformation

Some bacteria are capable of taking up DNA from their environment. These DNA remnants most commonly come from dead bacterial cells. During transformation, the bacterium binds the DNA and transports it across the bacterial cell membrane. The new DNA is then incorporated into the bacterial cell's DNA.

Transduction

Transduction is a type of recombination that involves the exchanging of bacterial DNA through bacteriophages. Bacteriophages are viruses that infect bacteria. There are two types of transduction: generalized and specialized transduction.Once a bacteriophage attaches to a bacterium, it inserts its genome into the bacterium. The viral genome, enzymes, and viral components are then replicated and assembled within the host bacterium. The newly formed bacteriophages then lyse or split open the bacterium, releasing the replicated viruses.During the assembling process however, some of the host's bacterial DNA may become encased in the viral capsid instead of the viral genome. When this bacteriophage infects another bacterium, it injects the DNA fragment from the previous bacterium. This DNA fragment then becomes inserted into the DNA of the new bacterium. This type of transduction is called generalized transduction.In specialized transduction, fragments of the host bacterium's DNA become incorporated into the viral genomes of the new bacteriophages. The DNA fragments can then be transfered to any new bacteria that these bacteriophages infect.
Share Your Opinions

Read more / Selengkapnya...

Cilia and Flagella

Cilia and flagella are motile cellular appendages found in most microorganisms and animals, but not in higher plants. In multicellular organisms, cilia function to move a cell or group of cells or to help transport fluid or materials past them. The respiratory tract in humans is lined with cilia that keep inhaled dust, smog, and potentially harmful microorganisms from entering the lungs. Among other tasks, cilia also generate water currents to carry food and oxygen past the gills of clams and transport food through the digestive systems of snails. Flagella are found primarily on gametes, but create the water currents necessary for respiration and circulation in sponges and coelenterates as well. For single-celled eukaryotes, cilia and flagella are essential for the locomotion of individual organisms. Protozoans belonging to the phylum Ciliophora are covered with cilia, while flagella are a characteristic of the protozoan group Mastigophora.

...


In eukaryotic cells, cilia and flagella contain the motor protein dynein and microtubules, which are composed of linear polymers of globular proteins called tubulin. The core of each of the structures is termed the axoneme and contains two central microtubules that are surrounded by an outer ring of nine doublet microtubules. One full microtubule and one partial microtubule, the latter of which shares a tubule wall with the other microtubule, comprise each doublet microtubule (see Figure 1). Dynein molecules are located around the circumference of the axoneme at regular intervals along its length where they bridge the gaps between adjacent microtubule doublets.

A plasma membrane surrounds the entire axoneme complex, which is attached to the cell at a structure termed the basal body (also known as a kinetosome). Basal bodies maintain the basic outer ring structure of the axoneme, but each of the nine sets of circumferential filaments is composed of three microtubules, rather than a doublet of microtubules. Thus, the basal body is structurally identical to the centrioles that are found in the centrosome located near the nucleus of the cell. In some organisms, such as the unicellular Chlamydomonas, basal bodies are locationally and functionally altered into centrioles and their flagella resorbed before cell division.

Eukaryotic cilia and flagella are generally differentiated based on size and number: cilia are usually shorter and occur together in much greater numbers than flagella, which are often solitary. The structures also exhibit somewhat different types of motion, though in both cases movement is generated by the activation of dynein and the resultant bending of the axoneme. The movement of cilia is often described as whip-like, or compared to the breast stroke in swimming. Adjacent cilia move almost simultaneously (but not quite), so that in groups of cilia, wave-like patterns of motion occur. Flagella, however, exhibit a smooth, independent undulatory type of movement in eukaryotes. Prokaryotic flagella, which have a completely different structure built from the protein flagellin, move in a rotating fashion powered by the basal motor.

Defects in the cilia and flagella of human cells are associated with some notable medical problems. For example, a hereditary condition known as Kartagener's syndrome is caused by problems with the dynein arms that extend between the microtubules present in the axoneme, and is characterized by recurrent respiratory infections related to the inability of cilia in the respiratory tract to clear away bacteria or other materials. The disease also results in male sterility due to the inability of sperm cells to propel themselves via flagella. Damage to respiratory cilia may also be acquired rather than inherited and is most commonly linked to smoking cigarettes. Bronchitis, for instance, is often triggered by a build-up of mucus and tar in the lungs that cannot be properly removed due to smoking-related impairment of cilia.

Read more / Selengkapnya...

Peroxisomes

Microbodies are a diverse group of organelles that are found in the cytoplasm of almost all cells, roughly spherical, and bound by a single membrane. There are several types of microbodies, including lysosomes, but peroxisomes are the most common. All eukaryotes are comprised of one or more cells that contain peroxisomes. The organelles were first discovered by the Belgian scientist Christian de Duve, who also discovered lysosomes.

...

Peroxisomes contain a variety of enzymes, which primarily function together to rid the cell of toxic substances, and in particular, hydrogen peroxide (a common byproduct of cellular metabolism). These organelles contain enzymes that convert the hydrogen peroxide to water, rendering the potentially toxic substance safe for release back into the cell. Some types of peroxisomes, such as those in liver cells, detoxify alcohol and other harmful compounds by transferring hydrogen from the poisons to molecules of oxygen (a process termed oxidation). Others are more important for their ability to initiate the production of phospholipids, which are typically used in the formation of membranes.

In order to carry out their activities, peroxisomes use significant amounts of oxygen. This characteristic of the organelles would have been extremely important millions of years ago, before cells contained mitochondria, when the Earth's atmosphere first began to amass large amounts of oxygen due to the actions of photosynthetic bacteria. Peroxisomes would have been primarily responsible at that time for detoxifying cells by decreasing their levels of oxygen, which was then poisonous to most forms of life. The organelles would have provided the cellular benefit of carrying out a number of advantageous reactions as well. Later, when mitochondria eventually evolved, peroxisomes became less important (in some ways) to the cell since mitochondria also utilize oxygen to carry out many of the same reactions, but with the additional benefit of generating energy in the form of adenosine triphosphate (ATP) at the same time.

Peroxisomes are similar in appearance to lysosomes, another type of microbody, but the two have very different origins. Lysosomes are generally formed in the Golgi complex, whereas peroxisomes self-replicate. Unlike self-replicating mitochondria, however, peroxisomes do not have their own internal DNA molecules. Consequently, the organelles must import the proteins they need to make copies of themselves from the surrounding cytosol. The importation process of peroxisomes is not yet well understood, but it appears to be heavily dependent upon peroxisomal targeting signals composed of specific amino acid sequences. These signals are thought to interact with receptor proteins present in the cytosol and docking proteins present in the peroxisomal membrane. As more and more proteins are imported into lumen of a peroxisome or are inserted into its membrane, the organelle gets larger and eventually reaches a point where fission takes place, resulting in two daughter peroxisomes. Illustrated in Figure 2 is a fluorescence digital image of an African water mongoose skin fibroblast cell stained with fluorescent probes targeting the nucleus (red), actin cytoskeletal network (blue), and peroxisomes (green).

Since the early 1980s, a number of metabolic disorders have been discovered to be caused by molecular defects in peroxisomes. Two major categories have been described so far. The first category consists of disorders of peroxisome biogenesis in which the organelle fails to develop normally, causing defects in numerous peroxisomal proteins. The second category involves defects of single peroxisomal enzymes. Studies indicate that approximately one in every 20,000 people has some type of a peroxisomal disorder. The most serious of these disorders is Zellweger syndrome, which is characterized by an absence or reduced number of peroxisomes in the cells. Present in patients at birth (congenital), Zellweger syndrome has no cure or effective treatment and usually causes death within the first year of life.

Read more / Selengkapnya...

Lysosomes

The main function of these microscopic organelles is to serve as digestion compartments for cellular materials that have exceeded their lifetime or are otherwise no longer useful. In this regard, the lysosomes recycle the cell's organic material in a process known as autophagy. Lysosomes break down cellular waste products, fats, carbohydrates, proteins, and other macromolecules into simple compounds, which are then transferred back into the cytoplasm as new cell-building materials. To accomplish the tasks associated with digestion, the lysosomes utilize about 40 different types of hydrolytic enzymes, all of which are manufactured in the endoplasmic reticulum and modified in the Golgi apparatus. Lysosomes are often budded from the membrane of the Golgi apparatus, but in some cases they develop gradually from late endosomes, which are vesicles that carry materials brought into the cell by a process known as endocytosis.

...

Like other microbodies, lysosomes are spherical organelles contained by a single layer membrane, though their size and shape varies to some extent. This membrane protects the rest of the cell from the harsh digestive enzymes contained in the lysosomes, which would otherwise cause significant damage. The cell is further safeguarded from exposure to the biochemical catalysts present in lysosomes by their dependency on an acidic environment. With an average pH of about 4.8, the lysosomal matrix is favorable for enzymatic activity, but the neutral environment of the cytosol renders most of the digestive enzymes inoperative, so even if a lysosome is ruptured, the cell as a whole may remain uninjured. The acidity of the lysosome is maintained with the help of hydrogen ion pumps, and the organelle avoids self-digestion by glucosylation of inner membrane proteins to prevent their degradation.

The discovery of lysosomes involved the use of a centrifuge to separate the various components of cells. In the mid-twentieth century, the Belgian scientist Christian Ren� de Duve was investigating carbohydrate metabolism of liver cells and observed that that the cells released an enzyme called acid phosphatase in larger amounts when they received proportionally greater damage in the centrifuge. To explain this phenomenon, de Duve suggested that the digestive enzyme was encased in some sort of membrane-bound organelle within the cell, which he dubbed the lysosome. After estimating the probable size of the lysosome, he was able to identify the organelle in images produced with an electron microscope.

Lysosomes are found in all animal cells, but are most numerous in disease-fighting cells, such as white blood cells. This is because white blood cells must digest more material than most other types of cells in their quest to battle bacteria, viruses, and other foreign intruders. Several human diseases are caused by lysosome enzyme disorders that interfere with cellular digestion. Tay-Sachs disease, for example, is caused by a genetic defect that prevents the formation of an essential enzyme that breaks down complex lipids called gangliosides. An accumulation of these lipids damages the nervous system, causes mental retardation, and death in early childhood. Also, arthritis inflammation and pain are related to the escape of lysosome enzymes.

Read more / Selengkapnya...

The Cytoskeleton

What is the cytoskeleton?



The cytoskeleton is a network of fibers throughout the cell's cytoplasm that helps the cell maintain its shape and gives support to the cell.

A variety of cellular organelles are held in place by the cytoskeleton.

Fibroblast cells. Fluorescent light micrograph of two fibroblast cells, showing their nuclei (purple) and cytoskeleton. The cytoskeleton is made up of microtubules of the protein tubulin (yellow) and filaments of the protein actin (blue). The cytoskeleton supports the cell's structure, allows the cell to move and assists in the transport of organelles and vesicles within the cell. Fibroblasts are cells forming connective tissue, and are responsible for secreting connective tissue proteins such as collagen.

...

What are some distinguishing characteristics?

The cytoskeleton is composed of at least three different types of fibers: microtubules, microfilaments and intermediate filaments.

These types are distinguished by their size with microtubules being the thickest and microfilaments being the thinnest.

• Microtubules are hollow rods functioning primarily to help support and shape the cell and as "routes" along which organelles can move. Microtubules are typically found in all eukaryotic cells.
• Microfilaments or actin filaments are solid rods and are active in muscle contraction. Microfilaments are particularly prevalent in muscle cells but similar to microtubules, they are also typically found in all eukaryotic cells.
• Intermediate filaments can be abundant in many cells and provide support for microfilaments and microtubules by holding them in place.In addition to providing support for the cell, the cytoskeleton is also involved in cellular motility and in moving vesicles within a cell, as well as assisting in the formation of food vacuoles in the cell.

Read more / Selengkapnya...

The Endoplasmic Reticulum

What is the endoplasmic reticulum?


The endoplasmic reticulum (ER) is a network of flattened sacs and branching tubules that extends throughout the cytoplasm in plant and animal cells. These sacs and tubules are all interconnected by a single continuous membrane so that the organelle has only one large, highly convoluted and complexly arranged lumen (internal space). Usually referred to as the endoplasmic reticulum cisternal space, the lumen of the organelle often takes up more than 10 percent of the total volume of a cell. The endoplasmic reticulum membrane allows molecules to be selectively transferred between the lumen and the cytoplasm, and since it is connected to the double-layered nuclear envelope, it further provides a pipeline between the nucleus and the cytoplasm.

...

The endoplasmic reticulum manufactures, processes, and transports a wide variety of biochemical compounds for use inside and outside of the cell. Consequently, many of the proteins found in the cisternal space of the endoplasmic reticulum lumen are there only transiently as they pass on their way to other locations. Other proteins, however, are targeted to constantly remain in the lumen and are known as endoplasmic reticulum resident proteins. These special proteins, which are necessary for the endoplasmic reticulum to carry out its normal functions, contain a specialized retention signal consisting of a specific sequence of amino acids that enables them to be retained by the organelle. An example of an important endoplasmic reticulum resident protein is the chaperone protein known as BiP (formally: the chaperone immunoglobulin-binding protein), which identifies other proteins that have been improperly built or processed and keeps them from being sent to their final destinations.

There are two basic kinds of endoplasmic reticulum morphologies: rough and smooth. The surface of rough endoplasmic reticulum is covered with ribosomes, giving it a bumpy appearance when viewed through the microscope. This type of endoplasmic reticulum is involved mainly with the production and processing of proteins that will be exported, or secreted, from the cell. The ribosomes assemble amino acids into protein units, which are transported into the rough endoplasmic reticulum for further processing. These proteins may be either transmembrane proteins, which become embedded in the membrane of the endoplasmic reticulum, or water-soluble proteins, which are able to pass completely through the membrane into the lumen. Those that reach the inside of the endoplasmic reticulum are folded into the correct three-dimensional conformation, as a flattened cardboard box might be opened up and folded into its proper shape in order to become a useful container. Chemicals, such as carbohydrates or sugars, are added, then the endoplasmic reticulum either transports the completed proteins to areas of the cell where they are needed, or they are sent to the Golgi apparatus for further processing and modification.

Most proteins exported from the endoplasmic reticulum exit the organelle in vesicles budded from the smooth portion, which has a more even appearance than rough endoplasmic reticulum when viewed through the electron microscope because of the lack of ribosomes. The smooth endoplasmic reticulum in most cells is much less extensive than the rough endoplasmic reticulum and is sometimes alternatively termed transitional. Smooth endoplasmic reticulum is chiefly involved, however, with the production of lipids (fats), building blocks for carbohydrate metabolism, and the detoxification of drugs and poisons. Therefore, in some specialized cells, such as those that are occupied chiefly in lipid and carbohydrate metabolism (brain and muscle) or detoxification (liver), the smooth endoplasmic reticulum is much more extensive and is crucial to cellular function. Smooth endoplasmic reticulum also plays a role in various cellular activities through its storage of calcium and involvement in calcium metabolism. In muscle cells, smooth endoplasmic reticulum releases calcium to trigger muscle contractions. Presented in Figure 2 is a fluorescence digital image taken through the microscope of the endoplasmic reticulum network in a bovine (cow) pulmonary artery endothelial cell grown in culture.

It is the rough endoplasmic reticulum that is directly continuous with the nuclear envelope (as illustrated in Figure 1), which is also studded with ribosomes, and the two organelles are thought to have evolved simultaneously in ancient cells. Due to their physical membranous connection, the lumen of the endoplasmic reticulum and the space between the layers of the nuclear envelope comprise a single compartment. Accordingly, the nucleus has direct access to proteins (many of which are produced by the ribosomes upon its surface) and other materials present in the endoplasmic reticulum lumen, so that transport vesicles are not needed to obtain them. The close association between the endoplasmic reticulum and the nucleus also enables the organelles to share information in a very efficient manner. For instance, if the endoplasmic reticulum begins to undergo functional problems and unfolded proteins accumulate within the organelle, which can be extremely hazardous to the cell, the organelle quickly sends a signal to the nucleus (as well as to the cytoplasm). The nucleus responds by slowing ribosomal translation through a several-step process, thereby giving the endoplasmic reticulum extra time to catch up on its protein folding, thus maintaining cellular health.

Read more / Selengkapnya...

Ribosomes

In Journey into the Cell, we looked at the structure of the two major types of cells: prokaryotic and eukaryotic cells. Now we turn our attention to the protein assemblers of a eukaryotic cell, the ribosomes.

Ribosomes are organelles that consist of RNA an proteins. They are responsible for assembling the proteins of the cell. Depending on the protein production level of a particular cell, ribosomes may number in the millions.

Distinguishing Characteristics:

Ribosomes are typically composed of two subunits: a large subunit and a small subunit. Ribosomal subunits are synthesized by the nucleolus. These two units join together when the ribosome attaches to messenger RNA to produce a protein in the cytoplasm.

...

Location in the Cell:

There are two places that ribosomes usually exist in the cell: suspended in the cytosol and bound to the endoplasmic reticulum. These ribosomes are called free ribosomes and bound ribosomes respectively. In both cases, the ribosomes usually form aggregates called polysomes.

Free ribosomes usually make proteins that will function in the cytosol, while bound ribosomes usually make proteins that are exported or included in the cell's membranes. Interestingly enough, free ribosomes and bound ribosomes are interchangeable and the cell can change their numbers according to metabolic needs.

Read more / Selengkapnya...

Journey Into The Cell: Mitochondria

In Journey into the Cell, we looked at the structure of the two major types of cells: prokaryotic (pro-) and eukaryotic (eu-) cells. Now we turn our attention to the "power houses" of a eukaryotic cell, the mitochondria.

What are mitochondria?

Mitochondria are the cell's power producers. They convert energy into forms that are usable by the cell. They are the sites of cellular respiration which ultimately generates fuel for the cell's activities.

Mitochondria Structural Features

Mitochondrion

...

What are their distinguishing characteristics?

Mitochondria are bounded by a double membrane. Each of these membranes is a phospholipid bilayer with embedded proteins. The outermost membrane is smooth while the inner membrane has many folds. These folds are called cristae. The folds enhance the "productivity" of cellular respiration by increasing the available surface area.

Muscle Cell Mitochondria, Copyright Dennis Kunkel

The double membranes divide the mitochondrion into two distinct parts: the intermembrane space and the mitochondrial matrix. The intermembrane space is the narrow part between the two membranes while the mitochondrial matrix is the part enclosed by the innermost membrane. Several of the steps in cellular respiration occur in the matrix due to its high concentration of enzymes.

Mitochondrion with matrix

Mitochondria are semiautonomous (semi- auto-) in that they can divide and grow to make more of themselves. They also have their own DNA and ribosomes.

Read more / Selengkapnya...

Journey into the Cell: The Nucleus

The Nucleus:

In Journey into the Cell, we looked at the structure of the two major types of cells: prokaryotic and eukaryotic cells. Now we turn our attention to the "nerve center" of a eukaryotic cell, the nucleus.

The nucleus is a membrane bound structure that contains the cell's hereditary information and controls the cell's growth and reproduction.

It is commonly the most prominent organelle in the cell.

Nucleus

Nucleus with Nuclear Pores

Liver Cell Nucleus with Dark Nucleolus

....

Distinguishing Characteristics:

The nucleus is bounded by a double membrane called the nuclear envelope. This membrane separates the contents of the nucleus from the cytoplasm.

The envelope helps to maintain the shape of the nucleus and assists in regulating the flow of molecules into and out of the nucleus through nuclear pores.

Chromosomes are also located in the nucleus.

When a cell is "resting" i.e. not dividing, the chromosomes are organized into long entangled structures called chromatin and not into individual chromosomes as we typically think of them.

The Nucleolus:

The nucleus also contains the nucleolus which helps to synthesize ribosomes.

The nucleolus contains nucleolar organizers which are parts of chromosomes with the genes for ribosome synthesis on them. Copious amounts of RNA and proteins can be found in the nucleolus as well.

The nucleus controls the synthesis of proteins in the cytoplasm through the use of messenger RNA. Messenger RNA is produced in the nucleolus of the cell and travels to the cytoplasm through the pores of the nuclear envelope.

Read more / Selengkapnya...

Enzim Restriksi

Salah satu sebab cepatnya perkenmbangan teknologi DNA adalah penemuan berbagai macam enzim yang dapat mengkatalisis pembelahan DNA di beberapa tempat yang dapat di produksi. Enzim ini disebut enzim restriksi atau endonuklease restriksi.

...

Semua nuklease, enzim yang ditemukan pertama kali mampu memecah ikatan fosfodiester asam nukleat, menunjukkan ketergantungan dalam urutan yang samhat kecil, yang paling spesifik adalah T1 RNase, yang diketahui hanya dapat memotong berikut tempat suatu sisa guanin. Pada RNA tertentu ditemukan tempat pemutusan yang sangat disukai, tetapi hal ini mencerminkan molekul RNA untai tunggal yang terlipat ke dalam susunan tiga simensi yang kompleks, dan bukan menunjukkan kecenderungan apapun bagi enzim untuk melakukan pemotongan dalam urutan basa tertentu. Pandangan umum yanh berlaku adlah bahwa nuklease yang sangat spesifik tidak akan pernah akan ditemukan, dan oleh sebab itu pemisahan fragmen DNA yang berlainan bahkan dari DNA virus, tidak akan mungkin. Satu - satunya dasar untuk berpikir lain adlah pengamatan, yang dimulai pasa awal tahun 1953, bahwa bila molekul DNA daei suatu galur E. coli dimasukkan kedalam galur E. coli yang lain, DNA tadi jarang berfungsi secara genetik. Malahan, DNA asing hampir selalu sepa dipecah - pecah ke dalam kepingan - kepingan kecil. jarang sekali molekul DNA yang menginfeksi tidak akan terurai, karena entah bagaimana caranya DNA itu mengalami midifikasi, sehingga DNA tadi dengan semua keturunannya sekarang dapat memperbanyak diri pada galur bakteri yang baru. Dalam tahun 1966 analisis kimia DNA virus kecil yang dimodifilasi dengan cara seperti itu, sehingga dapat mempertahankan diri dalam galur E. coli yang berbeda, mengungkapkan adanya satu atau beberapa basa yang termetilkan yang tidak terdapat dalam DNA yang tidak mengalami modifikasi. Basa termetilkan tidak disisipkan dalam bentuk itu ke dalam rantai DNA yang sedang tumbuh, bsa - basa itu timbul melalui edisi gugus metil yang dikatalisasi secara enzimatik ke dalam rantai DNA yang baru disintesiskan.
Enzim restriksi dibedakan dalam 2 golongan atas dasar cara enzim memecah DNA. Enzim golongan I mengenal urutan pasangan nukleotid spesifik dan kemudian memecah DNA pada tempat tidak spesifik jauh dari tempat pengolahan. Enzim yang terlibat dalam sistem restrilsi K dan B E. coli termasuk dalam golongan ini. sebaliknya, enzim golongan II, memecah DNA pada temat pengenalan spesifik. Endonuklease restriksi kelompok II telah diisolasi dalam sejumlah besar mikroorganisme.


Read more / Selengkapnya...

The Nucleus

The presence of a nucleus and other membranous orhanella characterizes eukaryotic celld. The nucleus houses the genetic material, DNA, which id complexed with an array of acidic and basic protein into thin fibers. During nondivisional phase of the cell cycle, these fibers are uncoiled and dispersed into chromatin.

Duriing mitosis and meiosis chromatin fibers coil and condense into structure called chromosomes. Also present in the nucleud id the nucleolus, an amorphous component where ribosomal RNA is synthesized and where the initial stages of ribosomal assembly occur. The areas of DNA encoding rRNA are collectively referred to as the nucleolus control region (NOR).

...

The lack of the nuclear envelope and membranaeous organelles is characteristic of prokaryotes. In bacteria such as a E. coli, the genetic material is present as a long, circular DNA molecule that is compacted into an area referred as the nucleotid area. Part of the DNA may be attached to the cell membrane, but in general the nucleotid cinstitutes a larhe area trougout the cell. Although the DNA is compacted, it does not undergo the extensive coiling characteristic of the stages of mitosis were, in eukaryotes, chromosome become visible. Nor is the DNA in these organism associated as extensively with proteins as is eukaryotic DNA. Prokaryotic cells do not have a distinct nucleolus, but do contain genes that specify rRNA molecules.

Read more / Selengkapnya...

DNA Molecular Biology Visualizations

...

DNA Molecular Biology Visualizations - Wrapping And Replication

Read more / Selengkapnya...

The Design Of The Sperm

...

That's HoW you were created.

Read more / Selengkapnya...

Transgenic Organism

Pemanfaatan Organisme Transgenik dan Produk yang Dihasilkannya

Teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetika telah melahirkan revolusi baru dalam berbagai bidang kehidupan manusia, yang dikenal sebagai revolusi gen. Produk teknologi tersebut berupa organisme transgenik atau organisme hasil modifikasi genetik (OHMG), yang dalam bahasa Inggris disebut dengan genetically modified organism (GMO). Namun, sering kali pula aplikasi teknologi DNA rekombinan bukan berupa pemanfaatan langsung organisme transgeniknya, melainkan produk yang dihasilkan oleh organisme transgenik. Dewasa ini cukup banyak organisme transgenik atau pun produknya yang dikenal oleh kalangan masyarakat luas. Beberapa di antaranya bahkan telah digunakan untuk memenuhi kebutuhan hidup sehari-hari. Berikut ini akan dikemukakan beberapa contoh pemanfaatan organisme transgenik dan produk yang dihasilkannya dalam berbagai bidang kehidupan manusia.
...

1. Pertanian

Aplikasi teknologi DNA rekombinan di bidang pertanian berkembang pesat dengan dimungkinkannya transfer gen asing ke dalam tanaman dengan bantuan bakteri Agrobacterium tumefaciens (lihat Bab XI). Melalui cara ini telah berhasil diperoleh sejumlah tanaman transgenik seperti tomat dan tembakau dengan sifat-sifat yang diinginkan, misalnya perlambatan kematangan buah dan resistensi terhadap hama dan penyakit tertentu.
Pada tahun 1996 luas areal untuk tanaman transgenik di seluruh dunia telah mencapai 1,7 ha, dan tiga tahun kemudian meningkat menjadi hampir 40 juta ha. Negara- negara yang melakukan penanaman tersebut antara lain Amerika Serikat (28,7 juta ha), Argentina (6,7 juta ha), Kanada (4 juta ha), Cina (0,3 juta ha), Australia (0,1 juta ha), dan Afrika Selatan (0,1 juta ha). Indonesia sendiri pada tahun 1999 telah mengimpor produk pertanian tanaman pangan transgenik berupa kedelai sebanyak 1,09 juta ton, bungkil kedelai 780.000 ton, dan jagung 687.000 ton. Pengembangan tanaman transgenik di Indonesia meliputi jagung (Jawa Tengah), kapas (Jawa Tengah dan Sulawesi Selatan), kedelai, kentang, dan padi (Jawa Tengah). Sementara itu, tanaman transgenik lainnya yang masih dalam tahap penelitian di Indonesia adalah kacang tanah, kakao, tebu, tembakau, dan ubi jalar.
Di bidang peternakan hampir seluruh faktor produksi telah tersentuh oleh teknologi DNA rekombinan, misalnya penurunan morbiditas penyakit ternak serta perbaikan kualitas pakan dan bibit. Vaksin-vaksin untuk penyakit mulut dan kuku pada sapi, rabies pada anjing, blue tongue pada domba, white-diarrhea pada babi, dan fish-fibrosis pada ikan telah diproduksi menggunakan teknologi DNA rekombinan. Di samping itu, juga telah dihasilkan hormon pertumbuhan untuk sapi (recombinant bovine somatotropine atau rBST), babi (recombinant porcine somatotropine atau rPST), dan ayam (chicken growth hormone). Penemuan ternak transgenik yang paling menggegerkan dunia adalah ketika keberhasilan kloning domba Dolly diumumkan pada tanggal 23 Februari 1997.
Pada dasarnya rekayasa genetika di bidang pertanian bertujuan untuk menciptakan ketahanan pangan suatu negara dengan cara meningkatkan produksi, kualitas, dan upaya penanganan pascapanen serta prosesing hasil pertanian. Peningkatkan produksi pangan melalui revolusi gen ini ternyata memperlihatkan hasil yang jauh melampaui produksi pangan yang dicapai dalam era revolusi hijau. Di samping itu, kualitas gizi serta daya simpan produk pertanian juga dapat ditingkatkan sehingga secara ekonomi memberikan keuntungan yang cukup nyata. Adapun dampak positif yang sebenarnya diharapkan akan menyertai penemuan produk pangan hasil rekayasa genetika adalah terciptanya keanekaragaman hayati yang lebih tinggi.

2. Perkebunan, kehutanan, dan florikultur

Perkebunan kelapa sawit transgenik dengan minyak sawit yang kadar karotennya lebih tinggi saat ini mulai dirintis pengembangannya. Begitu pula, telah dikembangkan perkebunan karet transgenik dengan kadar protein lateks yang lebih tinggi dan perkebunan kapas transgenik yang mampu menghasilkan serat kapas berwarna yang lebih kuat.
Di bidang kehutanan telah dikembangkan tanaman jati transgenik, yang memiliki struktur kayu lebih baik. Sementara itu, di bidang florikultur antara lain telah diperoleh tanaman anggrek transgenik dengan masa kesegaran bunga yang lama. Demikian pula, telah dapat dihasilkan beberapa jenis tanaman bunga transgenik lainnya dengan warna bunga yang diinginkan dan masa kesegaran bunga yang lebih panjang.
Sentuhan teknologi DNA rekombinan pada florikultur antara lain dilakukan dengan mengisolasi dan memanipulasi gen biru dan gen etilen biru sesuai dengan tujuan yang dikehendaki. Di Amerika Serikat dan Eropa bibit violet carnation akan diproduksi melalui teknik rekayasa genetika. Bibit violet carnation transgenik ini disebut dengan moonshadow. Bunga moonshadow memiliki sangat sedikit benang sari, dan bahkan sesudah dipotong bunga tidak mempunyai benang sari lagi sehingga kemungkinan perpindahan gen ke tanaman lain dapat dicegah.

3. Kesehatan

Di bidang kesehatan, rekayasa genetika terbukti mampu menghasilkan berbagai jenis obat dengan kualitas yang lebih baik sehingga memberikan harapan dalam upaya penyembuhan sejumlah penyakit di masa mendatang. Bahan-bahan untuk mendiagnosis berbagai macam penyakit dengan lebih akurat juga telah dapat dihasilkan.
Teknik rekayasa genetika memungkinkan diperolehnya berbagai produk industri farmasi penting seperti insulin, interferon, dan beberapa hormon pertumbuhan dengan cara yang lebih efisien. Hal ini karena gen yang bertanggung jawab atas sintesis produk-produk tersebut diklon ke dalam sel inang bakteri tertentu yang sangat cepat pertumbuhannya dan hanya memerlukan cara kultivasi biasa.
Berbagai macam vaksin juga telah diproduksi menggunakan teknik rekayasa genetika, misalnya vaksin herpes, vaksin hepatitis B, vaksin lepra, vaksin malaria, dan vaksin kolera. Kecuali vaksin kolera, vaksin-vaksin tersebut dapat diproduksi dengan lebih efisien dan dalam jumlah yang lebih besar daripada produksi secara konvensional. Penggunaan vaksin malaria sangat diperlukan karena banyak nyamuk malaria yang saat ini sudah resisten terhadap DDT.
Contoh lain kontribusi potensial rekayasa genetika di bidang kesehatan yang hingga kini masih menjadi tantangan besar bagi para peneliti dari kalangan kedokteran dan ahli biologi molekuler adalah upaya terapi gen untuk mengatasi penyakit-penyakit seperti kanker dan sindrom hilangnya kekebalan bawaan atau acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Begitu juga, berkembangnya resistensi bakteri patogen terhadap antibiotik masih membuka peluang penelitian rekayasa genetika di bidang kesehatan.

4. Lingkungan

Rekayasa genetika ternyata sangat berpotensi untuk diaplikasikan dalam upaya penyelamatan keanekaragaman hayati, bahkan dalam bioremidiasi lingkungan yang sudah terlanjur rusak. Dewasa ini berbagai strain bakteri yang dapat digunakan untuk membersihkan lingkungan dari bermacam-macam faktor pencemaran telah ditemukan dan diproduksi dalam skala industri. Sebagai contoh, sejumlah pantai di salah satu negara industri dilaporkan telah tercemari oleh metilmerkuri yang bersifat racun keras baik bagi hewan maupun manusia meskipun dalam konsentrasi yang kecil sekali. Detoksifikasi logam air raksa (merkuri) organik ini dilakukan menggunakan tanaman Arabidopsis thaliana transgenik yang membawa gen bakteri tertentu yang dapat menghasilkan produk untuk mendetoksifikasi air raksa organik.

5. Industri

Pada industri pengolahan pangan, misalnya pada pembuatan keju, enzim renet yang digunakan juga merupakan produk organisme transgenik. Hampir 40% keju keras (hard cheese) yang diproduksi di Amerika Serikat menggunakan enzim yang berasal dari organisme transgenik. Demikian pula, bahan-bahan food additive seperti penambah cita rasa makanan, pengawet makanan, pewarna pangan, pengental pangan, dan sebagainya saat ini banyak menggunakan produk organisme transgenik.
Permasalahan dalam Pemanfaatan Produk Teknologi DNA Rekombinan
Meskipun terlihat begitu besar memberikan manfaat dalam berbagai bidang kehidupan manusia, produk teknologi DNA rekombinan (organisme transgenik beserta produk yang dihasilkannya) telah memicu sejumlah perdebatan yang menarik sekaligus kontroversial apabila ditinjau dari berbagai sudut pandang. Kontroversi pemanfaatan produk rekayasa genetika antara lain dapat dilihat dari aspek sosial, ekonomi, kesehatan, dan lingkungan.

Aspek sosial

1. Aspek agama

Penggunaan gen yang berasal dari babi untuk memproduksi bahan makanan dengan sendirinya akan menimbulkan kekhawatiran di kalangan pemeluk agama Islam. Demikian pula, penggunaan gen dari hewan dalam rangka meningkatkan produksi bahan makanan akan menimbulkan kekhawatiran bagi kaum vegetarian, yang mempunyai keyakinan tidak boleh mengonsumsi produk hewani. Sementara itu, kloning manusia, baik parsial (hanya organ-organ tertentu) maupun seutuhnya, apabila telah berhasil menjadi kenyataan akan mengundang kontroversi, baik dari segi agama maupun nilai-nilai moral kemanusiaan universal. Demikian juga, xenotransplantasi (transplantasi organ hewan ke tubuh manusia) serta kloning stem cell dari embrio manusia untuk kepentingan medis juga dapat dinilai sebagai bentuk pelanggaran terhadap norma agama.

2. Aspek etika dan estetika

Penggunaan bakteri E coli sebagai sel inang bagi gen tertentu yang akan diekspresikan produknya dalam skala industri, misalnya industri pangan, akan terasa menjijikkan bagi sebagian masyarakat yang hendak mengonsumsi pangan tersebut. Hal ini karena E coli merupakan bakteri yang secara alami menghuni kolon manusia sehingga pada umumnya diisolasi dari tinja manusia.

Aspek ekonomi

Berbagai komoditas pertanian hasil rekayasa genetika telah memberikan ancaman persaingan serius terhadap komoditas serupa yang dihasilkan secara konvensional. Penggunaan tebu transgenik mampu menghasilkan gula dengan derajad kemanisan jauh lebih tinggi daripada gula dari tebu atau bit biasa. Hal ini jelas menimbulkan kekhawatiran bagi masa depan pabrik-pabrik gula yang menggunakan bahan alami. Begitu juga, produksi minyak goreng canola dari tanaman rapeseeds transgenik dapat berpuluh kali lipat bila dibandingkan dengan produksi dari kelapa atau kelapa sawit sehingga mengancam eksistensi industri minyak goreng konvensional. Di bidang peternakan, enzim yang dihasilkan oleh organisme transgenik dapat memberikan kandungan protein hewani yang lebih tinggi pada pakan ternak sehingga mengancam keberadaan pabrik-pabrik tepung ikan, tepung daging, dan tepung tulang.

Aspek kesehatan

1. Potensi toksisitas bahan pangan

Dengan terjadinya transfer genetik di dalam tubuh organisme transgenik akan muncul bahan kimia baru yang berpotensi menimbulkan pengaruh toksisitas pada bahan pangan. Sebagai contoh, transfer gen tertentu dari ikan ke dalam tomat, yang tidak pernah berlangsung secara alami, berpotensi menimbulkan risiko toksisitas yang membahayakan kesehatan. Rekayasa genetika bahan pangan dikhawatirkan dapat mengintroduksi alergen atau toksin baru yang semula tidak pernah dijumpai pada bahan pangan konvensional. Di antara kedelai transgenik, misalnya, pernah dilaporkan adanya kasus reaksi alergi yang serius. Begitu pula, pernah ditemukan kontaminan toksik dari bakteri transgenik yang digunakan untuk menghasilkan pelengkap makanan (food supplement) triptofan. Kemungkinan timbulnya risiko yang sebelumnya tidak pernah terbayangkan terkait dengan akumulasi hasil metabolisme tanaman, hewan, atau mikroorganisme yang dapat memberikan kontribusi toksin, alergen, dan bahaya genetik lainnya di dalam pangan manusia.
Beberapa organisme transgenik telah ditarik dari peredaran karena terjadinya peningkatan kadar bahan toksik. Kentang Lenape (Amerika Serikat dan Kanada) dan kentang Magnum Bonum (Swedia) diketahui mempunyai kadar glikoalkaloid yang tinggi di dalam umbinya. Demikian pula, tanaman seleri transgenik (Amerika Serikat) yang resisten terhadap serangga ternyata memiliki kadar psoralen, suatu karsinogen, yang tinggi.

2. Potensi menimbulkan penyakit/gangguan kesehatan

WHO pada tahun 1996 menyatakan bahwa munculnya berbagai jenis bahan kimia baru, baik yang terdapat di dalam organisme transgenik maupun produknya, berpotensi menimbulkan penyakit baru atau pun menjadi faktor pemicu bagi penyakit lain. Sebagai contoh, gen aad yang terdapat di dalam kapas transgenik dapat berpindah ke bakteri penyebab kencing nanah (GO), Neisseria gonorrhoeae. Akibatnya, bakteri ini menjadi kebal terhadap antibiotik streptomisin dan spektinomisin. Padahal, selama ini hanya dua macam antibiotik itulah yang dapat mematikan bakteri tersebut. Oleh karena itu, penyakit GO dikhawatirkan tidak dapat diobati lagi dengan adanya kapas transgenik. Dianjurkan pada wanita penderita GO untuk tidak memakai pembalut dari bahan kapas transgenik.
Contoh lainnya adalah karet transgenik yang diketahui menghasilkan lateks dengan kadar protein tinggi sehingga apabila digunakan dalam pembuatan sarung tangan dan kondom, dapat diperoleh kualitas yang sangat baik. Namun, di Amerika Serikat pada tahun 1999 dilaporkan ada sekitar 20 juta penderita alergi akibat pemakaian sarung tangan dan kondom dari bahan karet transgenik.
Selain pada manusia, organisme transgenik juga diketahui dapat menimbulkan penyakit pada hewan. A. Putzai di Inggris pada tahun 1998 melaporkan bahwa tikus percobaan yang diberi pakan kentang transgenik memperlihatkan gejala kekerdilan dan imunodepresi. Fenomena yang serupa dijumpai pada ternak unggas di Indonesia, yang diberi pakan jagung pipil dan bungkil kedelai impor. Jagung dan bungkil kedelai tersebut diimpor dari negara-negara yang telah mengembangkan berbagai tanaman transgenik sehingga diduga kuat bahwa kedua tanaman tersebut merupakan tanaman transgenik.

Aspek lingkungan

1. Potensi erosi plasma nutfah

Penggunaan tembakau transgenik telah memupus kebanggaan Indonesia akan tembakau Deli yang telah ditanam sejak tahun 1864. Tidak hanya plasma nutfah tanaman, plasma nutfah hewan pun mengalami ancaman erosi serupa. Sebagai contoh, dikembangkannya tanaman transgenik yang mempunyai gen dengan efek pestisida, misalnya jagung Bt, ternyata dapat menyebabkan kematian larva spesies kupu-kupu raja (Danaus plexippus) sehingga dikhawatirkan akan menimbulkan gangguan keseimbangan ekosistem akibat musnahnya plasma nutfah kupu-kupu tersebut. Hal ini terjadi karena gen resisten pestisida yang terdapat di dalam jagung Bt dapat dipindahkan kepada gulma milkweed (Asclepia curassavica) yang berada pada jarak hingga 60 m darinya. Daun gulma ini merupakan pakan bagi larva kupu-kupu raja sehingga larva kupu-kupu raja yang memakan daun gulma milkweed yang telah kemasukan gen resisten pestisida tersebut akan mengalami kematian. Dengan demikian, telah terjadi kematian organisme nontarget, yang cepat atau lambat dapat memberikan ancaman bagi eksistensi plasma nutfahnya.

2. Potensi pergeseran gen

Daun tanaman tomat transgenik yang resisten terhadap serangga Lepidoptera setelah 10 tahun ternyata mempunyai akar yang dapat mematikan mikroorganisme dan organisme tanah, misalnya cacing tanah. Tanaman tomat transgenik ini dikatakan telah mengalami pergeseran gen karena semula hanya mematikan Lepidoptera tetapi kemudian dapat juga mematikan organisme lainnya. Pergeseran gen pada tanaman tomat transgenik semacam ini dapat mengakibatkan perubahan struktur dan tekstur tanah di areal pertanamannya.

3. Potensi pergeseran ekologi

Organisme transgenik dapat pula mengalami pergeseran ekologi. Organisme yang pada mulanya tidak tahan terhadap suhu tinggi, asam atau garam, serta tidak dapat memecah selulosa atau lignin, setelah direkayasa berubah menjadi tahan terhadap faktor-faktor lingkungan tersebut. Pergeseran ekologi organisme transgenik dapat menimbulkan gangguan lingkungan yang dikenal sebagai gangguan adaptasi.
Tanaman transgenik dapat menghasilkan protease inhibitor di dalam sari bunga sehingga lebah madu tidak dapat membedakan bau berbagai sari bunga. Hal ini akan mengakibatkan gangguan ekosistem lebah madu di samping juga terjadi gangguan terhadap madu yang diproduksi.

4. Potensi terbentuknya barrier species

Adanya mutasi pada mikroorganisme transgenik menyebabkan terbentuknya barrier species yang memiliki kekhususan tersendiri. Salah satu akibat yang dapat ditimbulkan adalah terbentuknya superpatogenitas pada mikroorganisme.

5. Potensi mudah diserang penyakit

Tanaman transgenik di alam pada umumnya mengalami kekalahan kompetisi dengan gulma liar yang memang telah lama beradaptasi terhadap berbagai kondisi lingkungan yang buruk. Hal ini mengakibatkan tanaman transgenik berpotensi mudah diserang penyakit dan lebih disukai oleh serangga.
Sebagai contoh, penggunaan tanaman transgenik yang resisten terhadap herbisida akan mengakibatkan peningkatan kadar gula di dalam akar. Akibatnya, akan makin banyak cendawan dan bakteri yang datang menyerang akar tanaman tersebut. Dengan perkataan lain, terjadi peningkatan jumlah dan jenis mikroorganisme yang menyerang tanaman transgenik tahan herbisida. Jadi, tanaman transgenik tahan herbisida justru memerlukan penggunaan pestisida yang lebih banyak, yang dengan sendirinya akan menimbulkan masalah tersendiri bagi lingkungan

Read more / Selengkapnya...

DNA sequence

Prinsip Sekuensing DNA

Molekul DNA rekombinan yang memperlihatkan hasil positif dalam reaksi hibridisasi dengan fragmen pelacak sangat diduga sebagai molekul yang membawa fragmen sisipan atau bahkan gen yang diinginkan. Namun, hal ini masih memerlukan analisis lebih lanjut untuk memastikan bahwa fragmen tersebut benar-benar sesuai dengan tujuan kloning. Analisis antara lain dapat dilakukan atas dasar urutan (sekuens) basa fragmen sisipan.
Penentuan urutan (sekuensing) basa DNA pada prinsipnya melibatkan produksi seperangkat molekul/fragmen DNA yang berbeda-beda ukurannya tetapi salah satu ujungnya selalu sama. Selanjutnya, fragmen-fragmen ini dimigrasikan/dipisahkan menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid atau polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) agar pembacaan sekuens dapat dilakukan. Di bawah ini akan diuraikan sekilas dua macam metode sekuensing DNA.
...

Metode Maxam-Gilbert

Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode kimia yang dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977. Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3’. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap.
Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan piperidin. Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G, hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C.

Dari hasil PAGE dapat diketahui sekuens fragmen DNA yang dipelajari atas dasar laju migrasi masing-masing pita. Lajur kedua berisi fragmen-fragmen yang salah satu ujungnya adalah A atau G. Untuk memastikannya harus dilihat pita-pita pada lajur pertama. Jika pada lajur kedua terdapat pita-pita yang posisi migrasinya sama dengan posisi migrasi pada lajur pertama, maka dapat dipastikan bahwa pita-pita tersebut merupakan fragmen yang salah satu ujungnya adalah G. Sisanya adalah pita-pita yang merupakan fragmen dengan basa A pada salah satu ujungnya. Cara yang sama dapat kita gunakan untuk memastikan pita-pita pada lajur ketiga, yaitu dengan membandingkannya dengan pita-pita pada lajur keempat.
Seperti halnya pada elektroforesis gel agarosa, laju migrasi pita menggambarkan ukuran fragmen. Makin kecil ukuran fragmen, makin cepat migrasinya. Dengan demikian, ukuran fragmen pada contoh tersebut di atas dapat diurutkan atas dasar laju/posisi migrasinya. Jadi, kalau diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar, hasilnya adalah fragmen-fragmen dengan ujung TTGCCCCGCGTGGCGCAAAGG. Inilah sekuens fragmen DNA yang dipelajari.

Metode Sanger

Dewasa ini metode sekuensing Maxam-Gilbert sudah sangat jarang digunakan karena ada metode lain yang jauh lebih praktis, yaitu metode dideoksi yang dikembangkan oleh A. Sanger dan kawan-kawan pada tahun 1977 juga.
Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP.
Dengan dasar pemikiran itu sekuensing DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi akan terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi tetapi ujung 3’nya selalu berakhir dengan basa yang sama. Sebagai contoh, dalam reaksi yang mengandung ddATP akan diperoleh fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran yang semuanya mempunyai basa A pada ujung 3’nya.
Tabung ddATP menghasilkan dua fragmen dengan ukuran tiga dan tujuh basa; tabung ddCTP menghasilkan tiga fragmen dengan ukuran satu, dua, dan empat basa; tabung ddGTP menghasilkan dua fragmen dengan ukuran lima dan sembilan basa; tabung ddTTP menghasilkan dua fragmen dengan ukuran enam dan delapan basa. Di depan (arah 5’) tiap fragmen ini sebenarnya terdapat primer, yang berfungsi sebagai prekursor reaksi polimerisasi sekaligus untuk kontrol hasil sekuensing karena urutan basa primer telah diketahui.
Untuk melihat ukuran fragmen-fragmen hasil sekuensing tersebut dilakukan elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid sehingga akan terjadi perbedaan migrasi sesuai dengan ukurannya masing-masing. Setelah ukurannya diketahui, dilakukan pengurutan fragmen mulai dari yang paling pendek hingga yang paling panjang, yaitu fragmen dengan ujung C (satu basa) hingga fragmen dengan ujung G (sembilan basa). Dengan demikian, hasil sekuensing yang diperoleh adalah CCACGTATG. Urutan basa DNA yang dicari adalah urutan yang komplementer dengan hasil sekuensing ini, yaitu GGTGCATAC.

Pangkalan Data Sekuens DNA

Selama bertahun-tahun telah banyak sekuens DNA yang ditentukan oleh para ilmuwan di seluruh dunia, dan saat ini kebanyakan jurnal ilmiah mempersyaratkan penyerahan sekuens DNA terlebih dahulu untuk keperluan pangkalan data publik sebelum mereka menerima naskah selengkapnya dari para penulis/ilmuwan. Pengelola pangkalan data akan saling bertukar informasi tentang sekuens-sekuens yang terkumpul dan menyediakannya untuk akses publik sehingga semua pangkalan data yang ada akan menjadi nara sumber yang sangat bermanfaat.
Sekuens-sekuens baru terus bertambah dengan kecepatan yang kian meningkat. Begitu pula, sejumlah perangkat lunak komputer diperlukan agar data yang tersedia dapat dimanfaatkan dengan lebih baik.
EMBL di Eropa dan GenBank di Amerika Serikat merupakan dua pangkalan data sekuens DNA terbesar di dunia. Selain sekuens DNA, mereka juga mengelola data sekuens RNA dan protein. Sementara itu, beberapa perusahaan mempunyai pangkalan data sekuens DNA sendiri.
Ketika sekuens suatu fragmen DNA telah diketahui, hanya ada sedikit sekali gambaran yang dapat diperoleh dari sekuens tersebut. Analisis sekuens perlu dilakukan untuk mengetahui beberapa karakteristik pentingnya seperti peta restriksi, rangka baca, kodon awal dan kodon akhir, atau kemungkinan tempat promoternya. Di samping itu, perlu juga dipelajari hubungan kekerabatan suatu sekuens baru dengan beberapa sekuens lainnya yang telah terlebih dahulu diketahui. Biasanya, analisis semacam itu dilakukan menggunakan paket-paket perangkat lunak, misalnya paket GCG Universitas Wisconsin dan DNAstar.

Proyek-proyek Sekuensing Genom

Sejalan dengan berkembangnya mesin-mesin sekuensing DNA automatis (automatic DNA sequencer), sejumlah organisasi telah memberikan perhatian dan dukungan dana bagi penentuan sekuens genom berbagai spesies organisme penting. Beberapa genom yang ukurannya sangat kecil seperti genom virus HIV dan fag λ telah disekuens seluruhnya. Genom sejumlah bakteri, misalnya E. coli (4,6 x 106 pb), dan khamir Saccharomyces cerevisiae (2,3 x 107 pb) juga telah selesai disekuens. Sementara itu, proyek sekuensing genom tanaman Arabidopsis thaliana (6,4 x 107 pb) dan nematoda Caenorhabditis elegans saat ini masih berlangsung. Proyek Genom Manusia (Human Genom Project), yang diluncurkan pada tahun 1990 dan sebenarnya diharapkan selesai pada tahun 2005, ternyata berakhir dua tahun lebih cepat daripada jadwal yang telah ditentukan.
Pada genom manusia dan genom-genom lain yang berukuran besar biasanya dilakukan pemetaan kromosom terlebih dahulu untuk mengetahui lokus-lokus gen pada tiap kromosom. Selanjutnya, perpustakaan gen untuk suatu kromosom dikonstruksi menggunakan vektor YACs dan klon-klon YACs yang saling tumpang tindih diisolasi hingga panjang total kromosom tersebut akan tercakup. Demikian seterusnya untuk kromosom-kromosom yang lain hingga akhirnya akan diperoleh sekuens genom total yang sambung-menyambung dari satu kromosom ke kromosom berikutnya.

Read more / Selengkapnya...

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Pengertian dan Kegunaan PCR

Fragmen pelacak yang diperlukan dalam seleksi rekombinan merupakan molekul DNA untai ganda yang urutan basanya harus komplementer dengan sebagian urutan basa fragmen (gen) yang dilacak. Fragmen pelacak ini dibuat secara in vitro menggunakan teknik PCR. Namun, teknik yang ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1987 ini, tidak hanya digunakan untuk membuat fragmen pelacak, tetapi secara umum teknik ini merupakan cara untuk menggandakan urutan basa nukleotida tertentu secara in vitro.

...

Komponen dan Tahapan PCR

Penggandaan urutan basa nukleotida berlangsung melalui reaksi polimerisasi yang dilakukan berulang-ulang secara berantai selama beberapa putaran (siklus). Tiap reaksi polimerisasi membutuhkan komponen-komponen sintesis DNA seperti untai DNA yang akan digunakan sebagai cetakan (templat), molekul oligonukleotida untai tunggal dengan ujung 3’-OH bebas yang berfungsi sebagai prekursor (primer), sumber basa nukleotida berupa empat macam dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), dan enzim DNA polimerase.
DNA templat adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence). Penggandaan urutan target pada dasarnya merupakan akumulasi hasil polimerisasi molekul primer.
Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi (sekitar 95ºC). Salah satu enzim DNA polimerase yang umum digunakan adalah Taq DNA polimerase, yang berasal dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.
Tiap putaran reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi templat, penempelan primer, dan polimerisasi primer, yang masing-masing berlangsung pada suhu lebih kurang 95ºC, 50ºC, dan 70ºC. Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNA templat. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward primer) dan primer mundur (reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 5’ DNA templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5’ ke 3’ atau berarti dari ujung 3’ ke 5’ untai templatnya). Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA.
Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2n – 2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi).
Bisa kita bayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran saja, maka pada akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak 220 – 2.20 = 1.048576 – 40 = 1.048536 ! Jumlah ini masih dengan asumsi bahwa DNA templat awalnya hanya satu untai ganda. Padahal kenyataannya, hampir tidak mungkin DNA templat awal hanya berupa satu untai ganda. Jika DNA templat awal terdiri atas 20 untai ganda saja, maka jumlah tadi tinggal dikalikan 20 menjadi 20.970.720, suatu jumlah yang sangat cukup bila akan digunakan sebagai fragmen pelacak.

Perancangan Primer

Tahapan PCR yang paling menentukan adalah penempelan primer. Sepasang primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan dipolimerisasi masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya pada kedua ujung fragmen yang akan diamplifikasi. Untuk itu urutan basanya harus komplementer atau setidak-tidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan basa kedua daerah ujung fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum mengetahui dengan pasti urutan basa sekuens target. Oleh karena itu, diperlukan cara tertentu untuk merancang urutan basa kedua primer yang akan digunakan.
Dasar yang digunakan adalah urutan basa yang diduga mempunyai kemiripan dengan urutan basa sekuens target. Urutan ini adalah urutan serupa dari sejumlah spesies/strain organisme lainnya yang telah diketahui/dipublikasikan. Sebagai contoh, untuk merancang sepasang primer yang diharapkan dapat mengamplifikasi sebagian gen lipase pada isolat Bacillus termofilik tertentu dapat digunakan informasi urutan basa gen lipase dari strain-strain Pseudomonas fluorescens, P. mendocina , dan sebagainya, yang sebelumnya telah diketahui.
Urutan-urutan basa fragmen tertentu dari berbagai strain tersebut kemudian dijajarkan dan dicari satu daerah atau lebih yang memperlihatkan homologi tinggi antara satu strain dan lainnya. Daerah ini dinamakan daerah lestari (conserved area). Sebagian/seluruh urutan basa pada daerah lestari inilah yang akan menjadi urutan basa primer.
Sebenarnya, daerah lestari juga dapat ditentukan melalui penjajaran urutan asam amino pada tingkat protein. Urutan asam amino ini kemudian diturunkan ke urutan basa DNA. Dari satu urutan asam amino sangat mungkin akan diperoleh lebih dari satu urutan basa DNA karena setiap asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu triplet kodon. Dengan demikian, urutan basa primer yang disusun dapat merupakan kombinasi beberapa kemungkinan. Primer dengan urutan basa semacam ini dinamakan primer degenerate. Selain itu, primer yang disusun melalui penjajaran urutan basa DNA pun dapat merupakan primer degenerate karena urutan basa pada daerah lestari di tingkat DNA pun tidak selamanya memperlihatkan homologi sempurna (100%).
Urutan basa pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis menggunakan program komputer untuk mengetahui kemungkinan terjadinya primer-dimer akibat homologi sendiri (self-homology) atau homologi silang (cross-homology). Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinya salah tempel (mispriming), yaitu penempelan primer di luar sekuens target. Analisis juga dilakukan untuk mengetahui titik leleh (Tm) masing-masing primer dan kandungan GC-nya. Sepasang primer yang baik harus mempunyai Tm yang relatif sama dengan kandungan GC yang cukup tinggi.

Read more / Selengkapnya...

Perpustakaan Gen

Pengertian dan Macam Perpustakaan Gen

Suatu perpustakaan gen dapat diartikan sebagai sekumpulan sekuens (urutan) DNA dari suatu organisme yang masing-masing telah diklon ke dalam vektor tertentu untuk memudahkan pemurnian, penyimpanan, dan analisisnya. Pada dasarnya terdapat dua macam perpustakaan gen yang dapat dikonstruksi, bergantung kepada sumber DNA digunakan. Jika DNA yang digunakan adalah DNA genomik/kromosom, maka perpustakaan yang dihasilkan disebut perpustakaan genom. Sementara itu, jika DNA yang digunakan merupakan hasil transkripsi balik suatu populasi mRNA seperti yang umum dijumpai pada eukariot, maka perpustakaan yang diperoleh dinamakan perpustakaan cDNA.
Hal yang perlu diperhatikan ketika kita melakukan konstruksi suatu perpustakaan gen adalah bahwa perpustakaan tersebut harus merepresentasikan semua gen yang ada di dalam sumber DNA asalnya. Dengan perkataan lain, suatu perpustakaan gen dikatakan representatif apabila berisi semua sekuens aslinya. Selain itu, jika suatu perpustakaan tidak mengandung klon dalam jumlah yang mencukupi, maka sangat dimungkinkan hilangnya beberapa gen tertentu.
Untuk mendapatkan perpustakaan genom yang representatif, DNA genomik harus dimurnikan dan kemudian dipotong secara acak menjadi fragmen-fragmen yang ukurannya sesuai dengan keperluan kloning menggunakan vektor yang dipilih. Fraksionasi sel pada eukariot akan mengurangi kontaminasi oleh DNA organel (mitokondria, kloroplas). Oleh karena itu, pemurnian DNA genomik eukariot biasanya dilakukan dengan terlebih dahulu mengisolasi nukleus dan menghilangkan protein, lemak, serta makromolekul lain yang tidak diinginkan dengan memberikan protease dan melakukan ekstraksi fenol-kloroform. Sementara itu, DNA prokariot dapat diekstraksi langsung.
DNA genomik hasil pemurnian tersebut selanjutnya dipotong-potong secara acak. Pada dasarnya ada dua cara pemotongan, yaitu pemotongan fisik seperti sonikasi dan digesti menggunakan enzim restriksi. Pemotongan dengan enzim restriksi akan menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung tertentu (lihat Bab IX). Untuk mendapatkan fragmen-fragmen dengan ukuran relatif besar dilakukan digesti parsial dengan cara mengurangi jumlah enzim restriksi atau waktu pemotongan yang digunakan Dengan digesti parsial ini enzim restriksi tidak akan memotong DNA genomik pada setiap tempat pengenalan yang ada sehingga akan diperoleh fragmen-fragmen DNA genomik yang relatif panjang.

...

Besarnya Perpustakaan Gen

Besarnya suatu perpustakaan gen dilihat dari banyaknya rekombinan yang terdapat di dalamnya. Untuk menghitung banyaknya rekombinan yang harus ada di dalam suatu perpustakaan gen digunakan rumus sebagai berikut.
N = ln (1 – P) / ln (1 – f)
Pada rumus tersebut N adalah banyaknya rekombinan yang harus ada di dalam perpustakaan gen, P peluang yang diinginkan, dan f nisbah panjang fragmen sisipan terhadap panjang genom. Sebagai contoh, untuk mendapatkan fragmen sisipan berukuran 20 kb (20.000 pb) dengan peluang 0,99 diperlukan perpustakaan gen yang besarnya berbeda antara E .coli dan manusia.
N E. coli = ln (1 – 0,99) / ln (1 – 20.000 / 4,6 x 106) = 1,1 x 103
N manusia = ln (1 – 0,99) / ln (1 – 20.000 / 3 x 109) = 6,9 x 105
Kita bisa melihat bahwa banyaknya rekombinan yang diperlukan untuk mendapatkan fragmen dengan ukuran dan peluang yang sama ternyata berbeda, bergantung kepada panjang genom organismenya. Pada E. coli dengan panjang genom yang lebih pendek (4,6 x 106) daripada panjang genom manusia (3 x 109) diperlukan rekombinan yang lebih sedikit (1,1 x 103) daripada rekombinan untuk perpustakaan gen manusia (6,9 x 105).
Perhitungan seperti tersebut di atas juga dapat menjelaskan alasan bahwa apabila genom suatu prokariot dengan fragmen sisipan sepanjang 5 hingga 10 kb diklon menggunakan plasmid akan menghasilkan perpustakaan gen yang baik meskipun hanya membawa beberapa ribu rekombinan. Demikian pula, untuk genom-genom yang besar cukup diperlukan sedikit rekombinan meskipun fragmen sisipannya panjang. Penggunaan vektor yang dapat mengklon fragmen-fragmen panjang, misalnya kosmid dan YAC, memungkinkan konstruksi perpustakaan genom dengan jumlah rekombinan yang tidak terlalu besar.

Elektroforesis

Sebelum fragmen-fragmen DNA genomik hasil digesti restriksi diligasikan ke dalam suatu vektor tertentu (lihat Bab IX) terlebih dahulu perlu dilakukan pemeriksaan atas keberhasilan digesti tersebut. Untuk melihat keberhasilan digesti restriksi, DNA divisualisasikan menggunakan teknik elektroforesis. Namun, elektroforesis sendiri sebenarnya bukanlah teknik visualisasi DNA semata-mata karena teknik ini dapat juga digunakan untuk keperluan isolasi dan pemurnian fragmen DNA tertentu.
Prinsip kerja elektroforesis adalah memisahkan molekul-molekul bermuatan listrik berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan muatan listriknya. Khusus untuk DNA, pemisahan tidak didasarkan atas perbedaan muatan listriknya, tetapi menurut ukuran dan konformasi atau struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan adalah agarosa dan poliakrilamid. Gel agarosa digunakan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb), sedangkan gel poliakrilamid digunakan untuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil.
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Jika hubungan antara ukuran molekul dan laju migrasi dipetakan dalam suatu grafik logaritmik, maka akan diperoleh kurva linier. Oleh karena itu, kita dapat memperkirakan berat molekul suatu fragmen DNA dengan melihat atau membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui ukurannya.
Fragmen-fragmen DNA divisualisasikan di bawah sinar ultraviolet setelah terlebih dulu direndam di dalam larutan etidium bromid, pewarna yang akan menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa DNA. Perendaman dilakukan setelah migrasi dianggap cukup untuk dihentikan. Fragmen DNA akan nampak sebagai pita berwarna merah dengan posisi migrasi yang sesuai dengan berat molekulnya. Cara ini dapat memvisualisasikan fragmen DNA hingga sekecil 0,05 µg.
Seperti telah dikatakan di atas bahwa selain karena perbedaan ukurannya, laju migrasi DNA pada gel elektroforesis juga ditentukan oleh konformasi molekulnya. DNA dengan bentuk covalently closed circular (CCC) akan bergerak paling cepat, disusul berikutnya konformasi open circular (OC), dan yang terakhir linier. Oleh karena perbedaan konformasi menyebabkan perbedaan laju migrasi, maka penentuan ukuran suatu fragmen DNA selalu dilakukan pada konformasi linier.
Marilah kembali kita bicarakan visualisasi fragmen-fragmen DNA genomik hasil digesti restriksi. DNA genomik, baik yang utuh maupun yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi, perlu divisualisasikan pada gel elektroforesis. Begitu pula halnya dengan vektor utuh dan vektor yang telah dilinierkan serta vektor rekombinan hasil ligasi dengan fragmen DNA genomik (lihat Bab IX). Selain itu, molekul DNA marker yang telah diketahui ukurannya juga dimigrasikan sebagai standar untuk menentukan ukuran sampel-sampel DNA yang kita analisis.
DNA genomik utuh pada lajur 2 nampak sebagai pita dengan laju migrasi paling lambat. Jika dibandingkan dengan marker, akan terlihat bahwa ukurannya lebih besar dari 21,3 kb. Berikutnya pada lajur 3, DNA genomik yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi tertentu tervisualisasi sebagai pita melebar (smear). Pita ini merupakan kumpulan fragmen-fragmen DNA hasil pemotongan tersebut yang sangat bervariasi ukurannya. Sementara itu, pada lajur 4 dan 5 terlihat jelas perbedaan laju migrasi antara plasmid utuh yang mempunyai konformasi CCC dan plasmid linier hasil pemotongan dengan suatu enzim restriksi. Plasmid linier bergerak lebih lambat daripada plasmid CCC, dan posisi migrasinya digunakan untuk menentukan ukurannya (sekitar 4,9 kb). Terakhir pada lajur 6, plasmid rekombinan hasil ligasi dengan fragmen DNA genomik menunjukkan ukuran yang lebih besar dari 4,9 kb. Hal ini terlihat dari migrasinya yang lebih lambat daripada plasmid linier tanpa fragmen sisipan.

Prosedur Skrining

Proses untuk mengidentifikasi suatu klon yang membawa gen tertentu yang diinginkan di antara sejumlah besar klon lainnya di dalam perpustakaan gen dinamakan skrining. Pada dasarnya skrining dilakukan dengan teknik hibridisasi menggunakan suatu molekul pelacak DNA (DNA probe). Beberapa pengetahuan mengenai gen yang akan dicari, atau produknya, diperlukan dalam pembuatan molekul pelacak bagi gen tersebut. Di dalam proses skrining, molekul pelacak akan menempel pada sekuens DNA yang komplementer dengannya sehingga klon yang diinginkan dapat dikenali.
Apabila diperoleh protein yang merupakan produk gen tertentu dalam jumlah yang memungkinkan untuk penentuan sekuens asam aminonya, maka dari informasi sekuens asam amino ini dapat disusun beberapa kemungkinan sekuens DNA yang menyandinya. Selanjutnya, informasi sekuens DNA yang disusun dapat digunakan untuk membuat molekul pelacak.

Hibridisasi koloni dan plak

Seleksi transforman dengan vektor rekombinan yang dikonstruksi menggunakan vektor λ dilakukan dengan melihat terbentuknya plak pada medium kultur sel inang. Sementara itu, seleksi transforman dengan vektor rekombinan yang dikonstruksi menggunakan plasmid dilakukan dengan melihat pertumbuhan koloni pada medium seleksi. Namun, prosedur skrining bagi kedua sistem kloning tersebut pada dasarnya sama saja.
Langkah pertama adalah mentransfer DNA di dalam plak atau koloni ke suatu membran nilon atau nitroselulosa. Untuk plak, DNA λ dapat langsung diperoleh dan ditransfer ke membran karena plak merupakan area tempat keberadaan bakteri inang yang mengalami lisis. Akan tetapi, jika yang ditransfer ke membran adalah koloni-koloni bakteri, maka perlu dilakukan lisis sel bakteri untuk mendapatkan DNA. Sebelumnya, dibuat replika bagi koloni-koloni yang ditransfer tersebut di dalam medium kultur yang baru.
Lisis sel bakteri biasanya dilakukan dengan merendam membran nilon di dalam sodium dodesil sulfat (SDS) dan protease. Selanjutnya, DNA yang keluar dari sel didenaturasi menggunakan alkali sehingga diperoleh DNA untai tunggal, yang kemudian difiksasi ke membran dengan pengeringan atau iradiasi UV. Membran dicelupkan ke dalam larutan pelacak DNA dan diinkubasi agar terjadi hibridisasi antara pelacak, yang juga berupa untai tunggal, dan beberapa DNA untai tunggal yang komplementer dengannya. Pelacak DNA biasanya diberi label radioaktif.
Setelah hibridisasi, membran dicuci untuk menghilangkan sisa-sisa pelacak yang tidak terhibridisasi. Beberapa DNA di dalam membran yang mengalami hibridisasi divisualisasikan menggunakan autoradiografi dengan sinar X. Dengan membandingkan posisi DNA yang terhibridisasi oleh pelacak dengan posisi koloni pada kultur replika akan diketahui koloni-koloni yang membawa DNA rekombinan dengan fragmen sisipan yang diinginkan.

Skrining ekspresi

Pada dasarnya skrining ekspresi sama dengan skrining perpustakaan gen melalui hibridisasi koloni/plak. Hanya saja pada skrining ekspresi, bukannya DNA yang dideteksi pada membran, melainkan protein yang merupakan produk suatu gen yang diinginkan. Sebagai pelacak digunakan antibodi, sedangkan untuk mengetahui terjadinya hibridisasi digunakan antibodi lain atau bahan kimia yang dapat mengenalinya. Dengan cara seperti ini dapat ditentukan koloni/plak yang mengekspresikan protein yang dikehendaki.

Penghambatan dan pelepasan translasi oleh hibrid

Klon-klon cDNA dapat digunakan untuk menghibridisasi mRNA yang diisolasi. Setelah dilakukan hibridisasi, populasi mRNA langsung ditranslasi menjadi protein. Translasi tidak akan terjadi pada segmen mRNA yang terhibridisasi oleh cDNA, atau dengan perkataan lain, translasi telah dihambat oleh hibrid (hybrid-arrest translation). Dengan mendeteksi produk-produk protein yang tidak terbentuk dapat diketahui cDNA yang menghambat translasi suatu protein. Artinya, cDNA ini dapat dipastikan membawa sekuens yang menyandi protein yang tidak ditranslasi tersebut.
Cara kebalikannya juga dapat dilakukan. Hibrid-hibrid antara cDNA dan mRNA dimurnikan. Kemudian, mRNA dilepaskan dari hibrid dengan pemanasan atau menggunakan agen denaturasi. Setelah itu, mRNA ditranslasi (hybrid-release translation) untuk menghasilkan produk protein tertentu. Dengan mengetahui protein yang terbentuk dapat diketahui klon cDNA yang membawa sekuens penyandi protein tersebut.

Southern blotting dan Northern blotting

Kedua prosedur skrining ini digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens tertentu tetapi tidak dilakukan langsung pada klon-klon rekombinannya. Skrining didasarkan atas hasil hibridisasi antara molekul asam nukleat dan pelacaknya pada gel agarosa. Istilah Southern blotting berasal dari nama penemunya, sedangkan Northern blotting diekstrapolasi dari nama tersebut. Jika Southern blotting ditujukan untuk DNA, Northern blotting digunakan untuk hibridisasi RNA.
Tahap pertama untuk kedua prosedur tersebut adalah migrasi molekul asam nukleat pada gel agarosa. Khusus untuk Southern blotting, dilakukan denaturasi DNA (biasanya menggunakan alkali) sehingga akan diperoleh DNA untai tunggal. Pita-pita untai tunggal, baik DNA maupun RNA, kemudian dipindahkan ke membran nilon atau nitroselulosa seperti halnya pada hibridisasi koloni.
Begitu asam nukleat dipindahkan ke membran, tahap-tahap selanjutnya pada kedua prosedur skrining tersebut sama, yaitu fiksasi asam nukleat pada membran, hibridisasi dengan pelacak, pencucian sisa pelacak, dan deteksi fragmen yang mengalami hibridisasi menggunakan autoradiografi. Di antara tahap-tahap tersebut kondisi hibridisasi merupakan faktor yang paling memerlukan perhatian. Jika antara pelacak dan sekuens target terdapat homologi yang sangat tinggi (mendekati atau sama dengan 100%), maka dapat diberlakukan kondisi hibridisasi yang ketat, yaitu dengan suhu hibridisasi tinggi dan konsentrasi garam rendah pada bufer hibridisasi. Sebaliknya, jika sekuens pelacak tidak terlalu homolog dengan sekuens target, maka ketetatan kondisi hibridisasi harus diturunkan sampai pada tingkatan yang memungkinkan terbentuknya hibrid-hibrid yang kurang sempurna. Namun, jika keketatannya diturunkan terlalu banyak, fragmen pelacak mungkin akan berikatan dengan sekuens-sekuens lain yang tidak spesifik.
Southern blotting terhadap fragmen-fragmen DNA genomik yang diklon dapat dilakukan menggunakan pelacak berupa cDNA untuk mencari bagian-bagian klon genomik yang sesuai dengan fragmen cDNA pelacak. Jika fragmen DNA genomik yang membawa suatu gen tertentu dapat dideteksi, maka akan diketahui ukuran fragmen yang membawa gen tersebut. Blot-blot dengan sampel DNA atau RNA dari organisme yang berbeda (zoo blots) dapat menunjukkan betapa konservatifnya suatu gen di antara spesies yang satu dan lainnya.

Read more / Selengkapnya...